簡要描述:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已得到廣泛應(yīng)用;實(shí)時(shí)熒光定量PCR:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,Z后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time Quantitative PCR)
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。相對定量用于測定一個(gè)測試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對變化。校正樣本可以是一個(gè)未經(jīng)處理的對照或者是在一個(gè)時(shí)辰研究中處于零時(shí)的樣本。
相對定量應(yīng)用(Relative Quantification,RQ)
非特異性熒光標(biāo)記:
1、SYBR Green
SYBR Green特性:
(1)只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。
(2)變性時(shí),DNA雙鏈分開,無熒光。
(3)在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。
(4)SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光,所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析。
相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量:
內(nèi)標(biāo)(Endogenous Control)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因,在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定,受環(huán)境因素影響小,內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量。
相對定量分析方法:
2-ΔΔCt
前提:目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100%且偏差在5%以內(nèi)
1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值:
ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test)
ΔCT(calibrator)= CT(target,calibrator)-CT(ref, calibrator)
2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值:
ΔΔCT= ΔCT(test) - ΔCT(calibrator)
3、計(jì)算表達(dá)水平比率:
2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值
步驟 | 客 戶 提 供 | 服 務(wù) 內(nèi) 容 | 基 屹 提 供 |
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1 | 新鮮的且盡量多的材料;已知的全長基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來源、豐度等。 | DNA/RNA提取,根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 | |
2 | 純化好的DNA/RNA(大于5 ug/樣品);已知的全長基因序列;盡可能詳細(xì)的背景資料:DNA/ RNA來源、豐度等。 | 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。 | |
3 | 以DNA為模板,對目的基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測分析 | 提供完整的定量分析結(jié)果、實(shí)驗(yàn)熒光定量擴(kuò)增曲線及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟。 |
注意:客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同,選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目。