簡(jiǎn)要描述:對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA條帶進(jìn)行重新克隆,其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析,或者進(jìn)行重組改造等。亞克隆的基本過程包括:(1)目的DNA條帶和載體的制備;(2)目的DNA條帶和載體的連接;(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化;(4)重組子篩選。
亞克隆
已經(jīng)獲得的目的DNA條帶進(jìn)行重新克隆,其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析,或者進(jìn)行重組改造等。
亞克隆的基本過程包括:
(1)目的DNA條帶和載體的制備;(2)目的DNA條帶和載體的連接;(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化;(4)重組子篩選。
目的DNA條帶和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶,消化已知目的DNA和載體,獲得線性DNA,用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況,選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?,分別產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端(用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端)、不對(duì)稱粘性末端(用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端)、平端。在亞克隆時(shí),*不對(duì)稱相容末端連接,次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接,由于平末端連接效率較低,通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ,一般先將不匹配末端補(bǔ)平,然后再以平末端連接。
利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA條帶和載體的體外連接
外源DNA條帶末端性質(zhì) | 連接要求 | 連接結(jié)果 |
不對(duì)稱粘性末端 | 兩種限制酶消化后,需純化載體以提高連接效率 | 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)常可保留;非重組克隆的背景較低;外源DNA可以定向插入到載體中。 |
對(duì)稱性粘性末端 | 線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理 | 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)??杀A?;重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。 |
平端 | 要求高濃度的DNA和連接酶 | 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失;重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;非重組克隆的背景較高 。 |
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌,冰浴化開;
⑵ 加入適量連接產(chǎn)物(一般不超過10μl,輕輕混勻,冰浴20min;
⑶ 于42℃熱休克90s,迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中,繼續(xù)冰浴2-3min;
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl,于37℃緩搖孵育45min;
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板(根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG),待膠表面沒有液體流動(dòng)時(shí),37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。
重組子的篩選
根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補(bǔ)、抗生素基因等?,F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此,宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時(shí)存在時(shí),可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ),稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ 細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落,因而易于識(shí)別。然而,當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后,有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。